Исследование качества плавленных сыров в зависимости от пищевых добовок, Товароведение

Содержание

Определения, обозначения и сокращения6

Введение7

1.Аналитический обзор9

1.1.Пищевое значение плавленых сыров в питании человека9

1.1.1.Классификация плавленых сыров11

1.1.2.Ассортимент пищевых добавок для плавленых сыров и их влияние на вкусовую и пищевую ценность12

1.2. Технология производства плавленых сыров15

1.2.1. Рецептуры плавленых сыров22

1.2.2. Санитарные правила и нормы при изготовлении плавленых сыров23

1.3. Улучшение качества и пищевой ценности плавленых сыров при добавлении пищевых волокон25

1.3.1. Характеристика пектина25

1.3.2. Применение пектина в молочной промышленности26

2. Материалы и методы исследования30

2.1. Материалы исследования30

2.2. Методы исследования32

3. Результаты и их обсуждение34

3.1 Установление возможности использования казеината натрия в составе плавленых сырных продуктов34

3.2. Разработка технологического регламента производства гидролизата казоината натрия39

3.3 Испытание гидролизатов БРК в составе плавленых сырных продуктов46

Заключение57

Список использованных источников59

Выдержка из текста работы

Федеральное агенство по образованию ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ Тверской государственный университет Биологический факультет Специальность “биология” Кафедра биомедицины Дипломная работа Тема: ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЛИПИДНОГО СОСТАВА ПЕЧЕНИ И МЫШЦ ЛЯГУШКИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ИНКУБАЦИИ ТКАНИ Выполнила студентка 5 курса Гусева Е. Н. Научный руководитель: асс.,к. б. н. М. Б. Белякова Допущено к защите "___"________2008г. Зав. кафедрой, проф. ____________ А. Я. Рыжов Тверь, 2008

Список сокращений, используемых в тексте:

АДФ – аденозиндифосфат,

АТФ – аденозинтрифосфат,

ДГ – диацилглицерины,

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота,

ЖК – жирные кислоты,

КФ – креатинфосфат,

ЛП – липопротеиды,

ЛФ – лизофосфатиды,

ЛФЛ – лизофосфолипиды,

МГ – моноглицериды,

МТСХ – микротонкослойная хроматография,

NADH – восстановленный никотинамидадениндинуклеотид,

НЛ – нейтральные липиды,

НЭЖК – неэстерифицированные жирные кислоты,

ОКГ – острое кислородное голодание,

ОЛ – общие липиды,

ПВК – пировиноградная кислота,

ПГФ – полиглицерофосфатиды,

СЖК – свободные (неэстерифицированные) жирные кислоты,

ТГ – триацилглицерины,

ФК – фосфатидные кислоты,

ФЛ – фосфолипиды,

ФН – фосфат неорганический,

Х – холестерин,

ЭА – этаноламин,

ЭХ – эстерифицированный холестерин (эфиры холестерина).

Содержание

I. Введение…………………………………………………………………..4

II. Литературный обзор……………………………………………………6

2. 1. Липидный компонент мышц и печени и его метаболические функции………………………………………………………………………..6

2.2. Диффузия кислорода в тканях……………………………………….13

2.3. Влияние кислородной недостаточности на биохимические процессы в мышцах и печени……………………………………………………………19

2.3.1. Виды гипоксических состояний…………………………………..19

2.3.2. Особенности метаболизма мышц и печени при гипоксии………24

2.3.3. Липидный обмен в мышцах и печени при кислородной недостаточности………………………………………………………………30

2.4. Посмертные биохимические изменения липидов мышц и печени…35

III. Материалы и методы исследования………………………………42

3. 1. Объекты исследования…………………………………………….…42

3. 2. Получение опытного материала и инкубирование образцов……42

3. 3. Методы анализа липидов………………………………………….42

3. 3. 1. Получение и очистка общего липидного экстракта…………..42

3 .3. 2. Анализ общих липидов и их отдельных фракций…………….44

3. 4. Статистическая обработка результатов исследований……………..47

IV. Результаты работы и их обсуждение………………………………48

V. Выводы ……………………………………………………………….62

Список использованной литературы………………………………….63

I. Введение

Гипоксия (кислородное голодание) – состояние, возникающее при недостаточном снабжении тканей организма кислородом или нарушении его утилизации в процессе биологического окисления. Гипоксия вызывает огромный интерес исследователей, так как считается компонентом большинства патологических состояний, часто предшествуя гибели организма, сопровождая развитие посмертных изменений органов и тканей. При гипоксии в первую очередь страдают процессы энергетического обмена, то есть происходит резкое уменьшение содержания в клетках гликогена, АТФ, КФ. Таким образом, запасы энергии в клетках, находящихся в условиях дефицита кислорода, оказываются недостаточными для поддержания нормальной жизнедеятельности клеток. Одним из первых проявлений этого состояния является нарушение мембранной проницаемости за счет нарушения липидного обмена. Центральное место при развитии гипоксии и других энергодефицитных состояний могут занимать аутолитические процессы.

Аутолиз клетки связывается с деградацией структурных компонентов мембран, в связи с чем значительный интерес вызывают посмертные изменения липидного компонента. Гипоксия приводит к значительной перестройке обмена липидов, характеризующейся, в частности, ограничением их биологического окисления, поэтому должна неоднозначно влиять на липидный состав переживающих тканей. Число работ, посвященных изучению этой темы, невелико, но они указывают на подверженность посмертных превращений липидов влиянию кислородных условий и чувствительность к различным видам моделирования аутолиза.

Цель работы: исследовать влияние различных условий инкубации на изменения липидного состава печени и мышц лягушки.

Задачи:

1) изучить изменения содержания общих липидов и их фракций в мышцах и печени лягушки при часовой и суточной инкубации в бескислородной и насыщенной кислородом среде;

2) исследовать изменения липидного состава мышц при часовой и суточной экспозиции неизолированной ткани;

3) сравнить липидный состав мышц при часовой и 24-часовой экспозиции in situ и in vitro;

4) оценить влияние начального насыщения среды кислородом на изменение содержания липидов в препаратах мышц и печени при часовой и суточной инкубации.

II. Литературный обзор

Липиды играют важную роль в жизнедеятельности всех клеток с самого начала эволюции, и за это время стали неотъемлемыми компонентами самых различных биологических процессов и структур. Несмотря на длительную историю их изучения, современные исследователи постоянно расширяют научное представление о составе и функциях липидов в различных тканях. Изучается их участие в передаче сигналов, адаптации к воздействиям, реализации генетической информации, апоптозе и др. Привлекает внимание функциональный смысл своеобразия липидного состава мышц и печени, лабильности их липидного компонента. Эксперименты, включающие изучение липидов различных органов и тканей могут использоваться как аналитический компонент в конструкции представлений о сдвигах тканевого обмена при патологических и физиологических воздействиях.

2.1. ЛИПИДный компонент мышц И ПЕЧЕНИ и его метаболические функции

В мышцах и печени липиды представлены 5 основными классами:

1) фосфолипиды – многочисленная гетерогенная группа сложных липидов, являющаяся сложными эфирами глицерина (или диольных спиртов) и жирных кислот, содержащими один или несколько остатков фосфорной кислоты, азотистые основания или углевод;

фосфолипиды подразделяются на глицерофосфолипиды и сфинголипиды [4]:

фосфатидные кислоты фосфатидилхолины

O O|| ||

O CH₂-O-C-R₁ O CH₂-O-C-R₁

|| | || |

R₂-C-O-CH O R₂-C-O-CH O

| || | || +

CH₂-O-P-OH CH₂-O-P-О-CH₂-CH₂-Nº(CH₃)₃

½ |

ОH O^—

Построены из ФК и Х

Фосфатидилэтаноламины

O||O CH₂-O-C-R1

|| |R₂-C-O-CH O построены из ФК и ЭА

| || +

CH₂-O-P-O-CH₂-CH₂-NH₃

|O-Фосфатидилсерины Фосфатидилинозиты

O O|| ||

O CH₂-O-C-R₁O CH₂-O-C-R₁

|| | || | ОH OH

R₂-C-O-CH O R₂-C-O-CH O OH

| || | || | OH

CH₂-O-P-O-CH₂-CH-COO^— CH₂-O-P––O

| +| | OH

О- NH₃ О-

построены из ФК и серина построены из ФК и шестиуглеродного

циклического спирта инозитола

2) стерины и стериды: липиды, относящиеся к этому классу, являются производными циклопентанпергидрофенантрена (свободный и эстерифицированный холестерин);

3) гликолипиды: цереброзиды, ганглиозиды;

4) нейтральные липиды: триацилглицерины, диацилглицерины, жирные кислоты и др.

триглицерин /общая схема строения/

Н О| ||

H-C-O-C-R₁

O|| где R₁, R₂ и R₃ – остатки высших жирных кислот

H-C-O-C-R₂

O олеиновая кислота /ненасыщенная жирная килота/

|| CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇-COOH

H-C-O-C-R₃

|HСодержание липидов в печени, по литературным данным, может находиться в широком диапазоне значений: 2-6% от сырой массы органа (чаще около 5%) в норме, и увеличиваться до 20% и более при физиологических нагрузках и патологиях, поскольку печень подвержена отекам и жировому перерождению. Содержание нейтральных липидов в печени составляет 1-1,5 % сырой массы, фосфолипидов – 1,5 -3%, холестерина — 0,3-0,5 %. [14].

Применение различных методов выделения, фракционирования и количественного определения липидов также могут приводить к неоднозначности результатов, полученных разными исследователями; с осторожностью следует относиться к данным о высоком содержании лизофосфатидов в печени, которые могут появляться вследствие деструкции препарата (см. табл.1)

Таблица 1

Фосфолипидный состав плазматической мембраны гепатоцита (в % от суммарного количества фосфолипидов) [14]

	Daum G.	Korn; Jain, Wagner; Stoffel
Фосфатидилхолин
Фосфатидилэтаноламин
Фосфатидилинозит		12,8
Сфингомиелин
Фосфатидилсерин		5,7
Фосфатидная кислота		Нет данных
Лизофосфоглицериды		Нет данных
Кардиолипин		Нет данных
Гликолипиды	—

Липидный компонент мышц и печени характеризуется не только многообразием своего состава, но и многочисленностью выполняемых ими функций, основные из которых представлены в таблице.

Таблица 2

Функции липидов в мышцах и печени [4, 14].

Класс липидов	Выполняемые функции
Глицерофос-фолипиды (ФХ, ФЭА, ФС, ФИ, ФК, ЛФЛ)	1. ФХ, ФЭА, ФС – структурная. 2. ФИ – регуляторы работы ионных каналов. 3. Восприятие, хранение и передача информации. 4. ФХ, ФИ — секреция медиаторов. 5. Вторичные мессенджеры.
Сфинголипиды	1. Структурная. 2. СФМ — модуляторы активности мембраносвязанных ферментов. 3. Сфингозин, церамиды: – вторичные мессенджеры, — сигналы пролиферации, дифференциации, гибели клеток, — участие в апоптозе клеток, — регулируют гомеостаз ионов кальция в клетке, — медиаторы.
Стерины	1. Структурная. 2. Связывание с кальциевыми блокаторами. 3. ХС — участие в работе Са²⁺, Na⁺, Mg²⁺, K⁺ – насосов.
Гликолипиды	1. Структурная. 2. Восприятие, хранение и передача информации.
Нейтральные липиды	1. СЖК: — энергетические субстраты, — ионофоры, детергенты, хаотропные вещества, — индукция апоптоза, — регуляторы работы ионных каналов, — разобщители окислительного фосфорилирования, — участие общего пула СЖК в протекании реакций биотрансформации, включая рециклинг в метаболических взаимоотношениях различных классов липидов. 2. Арахидоновая кислота: – предшественник при биосинтезе простагландинов, лейкотриенов и др., – Са²⁺ — ионофор, – вторичный мессенджер . 3. ДГ — вторичный мессенджер. 4. ТГ: — доноры СЖК в липидном обмене, — депонирование, — апоптоз.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что липиды в тканях выполняют важные биоэффекторные функции, модулируя деятельность различных ферментов (фосфолипаз, АТФ-аз, протеинкиназ и пр.), ионных каналов, участвуют в передаче гормонального сигнала, транскрипции генов, регулируют жизненный цикл, апоптоз и программированную гибель клеток. Разнообразные и многочисленные биологические функции липидов позволяют этим веществам участвовать в регулировании различных физиологических и патологических процессов в клетках.

Интенсивность окислительно–восстановительных процессов в мышцах и необходимость постоянного синтеза макроэргов обусловливает особую чувствительность клеток к гипоксии. Гепатоциты содержат значительное количество митохондрий, и интенсивность окислительного фосфорилирования в них высокая, поскольку гомеостатическая роль печени также требует больших энергозатрат, поэтому гипоксия в значительной степени изменяет биохимические процессы в гепатоцитах. Учитывая вышеизложенное разнообразие функций липидного компонента мышц и печени, представляет интерес изучение метаболизма липидов в условиях гипоксии – фактора многих физиологических и патологических состояний.

2.2. Диффузия кислорода в тканях

В тканях кровь отдает кислород и поглощает углекислоту. Газообмен в капиллярах тканей большого круга, так же как и в легочных капиллярах, обусловлен диффузией вследствие разности парциальных напряжении газов в крови и в тканях.

Клетки весьма энергично потребляют кислород, поэтому его парциальное напряжение в протоплазме клеток очень низко, а при усилении их активности может быть равно нулю. В тканевой жидкости напряжение кислорода колеблется между 20 и 40 мм. Вследствие этого кислород непрерывно поступает из артериальной крови, приносимой к капиллярам большого круга кровообращения (здесь напряжение кислорода равно 100 мм рт. ст.), в тканевую жидкость. В результате в оттекающей от тканей венозной крови напряжение кислорода значительно ниже, чем в артериальной, составляя 40 мм [28].

Кровь, проходя по капиллярам большого круга, отдает не весь свой кислород. Артериальная кровь содержит около 20 об. % кислорода, венозная же кровь — примерно 12 об. % кислорода. Таким образом, из 20 об. % кислорода ткани получают 8 об. %, т. е. 40% всего кислорода, содержащегося в крови.

То количество кислорода в процентах от общего содержания его в артериальной крови, которое получают ткани, носит название коэффициента утилизации кислорода. Его вычисляют путем определения разности содержания кислорода в артериальной и венозной крови. Эту разность целят на содержание кислорода в артериальной крови и умножают на 100 [28].

Коэффициент утилизации кислорода меняется в зависимости от ряда физиологических условий. В покое организма он равен 30—40%. При тяжелой мышечной работе содержание кислорода в оттекающей от мышц венозной крови уменьшается до 8—10 об. % и, следовательно, утилизация кислорода повышается до 50—60%.

Более быстрый переход кислорода в ткани обеспечивается раскрытием нефункционировавших капилляров в работающей ткани. Повышению коэффициента утилизации способствует также усиленное образованно кислот — молочной и угольной, что понижает сродство гемоглобина к кислороду и обеспечивает более быструю диффузию кислорода из крови. Haконец, увеличению утилизации кислорода содействуют повышение температуры работающих мышц и усиление ферментативных и энергетических процессов, протекающих в клетках. Таким образом, доставка кислорода к тканям регулируется в соответствии с интенсивностью окислительных процессов [15].

Транспорт O₂ из крови в те участки ткани, где он используется, происходит путем простой диффузии. Поскольку кислород используется главным образом в митохондриях, расстояния, на которые происходит диффузия в тканях, представляются большими по сравнению с обменом в легких. В мышечной ткани присутствие миоглобина, как полагают, облегчает диффузию O₂. Для вычисления тканевого Po₂ созданы теоретически модели, которые предусматривают факторы, влияющие на поступление и потребление O₂, а именно расстояние между капиллярами, кроваток в капиллярах и тканевой метаболизм. Самое низкое Po₂ установлено в венозном конце и на полпути между капиллярами, если принять, что кровоток в капиллярах одинаковый и что они параллельны.

Поскольку каждый орган имеет свои характерные морфологические и функциональные особенности, можно полагать, что это определяет особый характер утилизации им кислорода. Несомненный интерес представляет вопрос о том, являются ли окислительные процессы в тканях первичными или вторичными, иначе говоря, в какой мере каждый орган или каждая ткань являются автономными в потреблении кислорода, обусловленном специфической функцией данного органа. Многочисленными исследованиями доказано, что ткань извлекает кислород в меру своих потребностей, оставляя избыток его в крови. Доставка кислорода, превышающая потребность в нем тканей в норме, не превышает его потребления. Судить о потреблении тканями кислорода в физиологических условиях можно по величине дыхательного коэффициента. Однако для патофизиологического анализа знание этих величин крайне недостаточно. Для более точной характеристики кислородного бюджета органа необходим учет важнейших факторов, определяющих утилизацию кислорода: коэффициента диффузии, величины капиллярного орошения и мощности внутриклеточной окислительно-восстановительной системы [30].

Первые представления о диффузии кислорода в ткани были получены на основании исследований Крога. Он пользовался тонкими плоскими мышцами лягушки в качестве мембран. По одну сторону такой мембраны помещалась насыщенная кислородом кровь, по другую — восстановленная. Кислород, продиффундировавший через мышцу, определялся газоаналитическим путем. Количество кислорода, прошедшее через площадь 1 см2 в 1 минуту при разности парциальных давлений кислорода в 1 атм., Крог назвал константой диффузии. В дальнейшем все исследования по утилизации кислорода изолированными тканями проводились на основе измерений скорости диффузии. Варбург, Мейергоф, Гилл учитывали ее скорость при градиенте 1 атм. на 1 см, а не на 1 мю. Сложность определения константы диффузии при изучении даже in vitro заключается в необходимости учета толщины слоя дышащей ткани. Гилл показал, что скорость диффузии в разных слоях ткани различна. Наибольшая скорость диффузии будет в поверхностном слое, снижаясь по направлению в глубину. Парнасом было показано, что для данного размера мышц можно подобрать такое парциальное давление кислорода, при котором происходит оптимальная утилизация его органом.
Всякое повышение парциального давления кислорода сверх этой величины не сопровождается увеличением потребления, в то время как понижение его ведет к снижению утилизации кислорода [7].

В физиологических условиях утилизация кислорода мышцей находится в тесной зависимости от ее работы, которая ведет к усилению дыхания. Максимальный (рассчитанный на радиус волокна) коэффициент диффузии кислорода (DO₂) в скелетных мышечных волокнах в условиях их относительного покоя у различных позвоночных (хариуса, крысы, тюленя, курицы) равняется (9-18).10-7 см²/с, будучи на порядок ниже, чем DO₂ в воде (24·10^-6 см²/с при 37°С). Причем размер волокна, его кислородный запрос и концентрация миоглобина не оказывали существенное влияние на этот показатель [15].

Использование полученной величины DO₂ в численных экспериментах (Лябах, Шошенко, 1991) показало, что при высоком кислородном запросе в волокне может развиваться гипоксия, несмотря на достаточный кровоток — возникает фуккциональное шунтирование кровотока. Поэтому волокно с высоким O₂-запросом имеет, как правило, меньший диаметр и большую васкуляризацию. Оба фактора уменьшают расстояние для диффузии O₂ внутри волокна.

Однако измерения DO₂ в мышечных волокнах во время их онтогентического роста (1991, 1995) выявили четкую зависимость DO₂ от диаметра волокна: чем тоньше волокно, тем ниже в нем DO₂: у куриных эмбрионов по сравнению со зрелыми курами волокна в 9 раз тоньше, а DO₂ в 44 раза меньше. Если считать, что основным препятствием для кислорода служит клеточная мембрана, то расчетный DO₂, возможно, и не меняется в онтогенезе, но тогда величина его многократно ниже.

В экспериментах на изолированной скелетной мышце зрелых крыс удалось показать (2000), что DO₂ в волокне может меняться в связи с изменением его кислородной потребности. Так, при увеличении скорости дыхания волокна в 1,9 раза DO₂ в нем растет, примерно, на 30%. В дальнейшем оказалось, что любое повреждение структуры органа создает кратковременную фазу увеличения клеточного дыхания. Даже спирты и уретан, которые повреждают окислительно-восстановительную систему клетки, в начале своего действия усиливают дыхание [15].

Следующим важным фактором диффузии кислорода является объем жидкости, через который он диффундирует. Впервые Бателли и Штерн, а затем Сцент-Гиорги указали на необходимость учета эффекта разбавления при изучении дыхания измельченной ткани. Интенсивность дыхания неповрежденных органов, по-видимому, не зависит от эффекта разбавления, однако в патологических условиях (отечные ткали) этот фактор с несомненностью может оказывать влияние на диффузию кислорода.

Таким образом, изучение изолированных тканей позволяет прийти к заключению, что нормальная утилизация кислорода тканями обусловлена коэффициентом диффузии, который в первую очередь зависит от парциального давления кислорода, целости клеточной структуры ткани и от фактора разбавления. Ткани извлекают кислород из капиллярной крови при постоянном потреблении имеющегося кислорода. Так как утилизация кислорода клеткой пропорциональна скорости диффузии, то совершенно понятно, что в условиях усиленной работы и особенно при патологии коэффициент диффузии будет подвержен ряду изменений. В патологических условиях на скорость диффузии могут оказывать влияние нарушения проницаемости капиллярной мембраны и загрузка тканевой жидкости белковым субстратом, который сразу понизит скорость проникновения кислорода (Эппингер). В нормальных условиях незначительные нарушения быстро восстанавливаются при удалении накопившихся веществ лимфатической системой. В большинстве случаев при патологии имеет место одновременное замыкание лимфатической системы, что еще больше понижает скорость диффузии кислорода. Нельзя не отметить, что роль повышения проницаемости капилляров в патологии часто переоценивается. Даже при шоке и острой инфекции не было получено повышения проницаемости капилляров для белка (Стэд и Уэрен) [30].

Скорость диффузии теснейшим образом связана не только с процессами утилизации в тканях, но и с оксигенацией и восстановлением гемоглобина. Как известно, скорость этих реакций очень велика, однако восстановление протекает во много раз медленнее, чем оксигенация, что само по себе является адаптационным механизмом, обеспечивающим нормальное снабжение органов кислородом. Длительность этих процессов в организме зависит главным образом от скорости диффузии, а так как время диффузии обратно пропорционально различию в интра- и экстракапиллярном давлении, то последнее становится важной величиной в определении скорости диффузии кислорода. Непосредственное измерение интра- и экстракапиллярного давления кислорода представляет большие трудности и некоторое приближенное представление о нем можно получить, отложив точку артерии и точку вены на кривой диссоциации.

Тогда утилизация кислорода каждым органом характеризуется соответствующим отрезком кривой.

По данным, полученным на здоровых собаках, утилизация кислорода для мозга, учитываемая по отрезку кривой диссоциации оксигемоглобина, соответствует разности парциальных давлений между 86 и 56 мм, для мышцы — между 86 и 52 мм. По данным Даля, Кендаля, Эмерсона, утилизация кислорода тканью почки может быть охарактеризована таким же отрезком кривой, который свойствен для мозга [30].

В печени утилизация тканью кислорода определяется по участку кривой диссоциации оксигемоглобина, соответствующему меньшим значениям парциального давления кислорода. Для мозга допустимо предположение, что специфическая функция его обеспечивается утилизацией кислорода при более высоком парциальном давлении.

Если жизнь в клетках организма может продолжаться при необычно низком парциальном давлении кислорода, по крайней мере в течение нескольких часов, то в клетках мозга нервная функция, теснейшим образом связанная с сохранением постоянного и адекватного давления кислорода, чрезвычайно быстро угасает. По наблюдениям Баркрофта, жизнь тканей мозга, отграниченных от циркуляции крови, продолжалась в течение 36 часов, но нервная функция их прекратилась через несколько секунд.

Следовательно, нервная ткань исключительно чувствительна к внезапному падению парциального давления кислорода.

Таким образом, в условиях патологии для учета степени утилизации кислорода в организме исключительно важная роль принадлежит скорости диффузии, величине разности значений парциального давления кислорода в артерии и вене и ее проекции на соответствующем участке кривой диссоциации оксигемоглобина.

Для удовлетворения большой потребности органов и тканей в кислороде организм располагает рядом приспособлений.

1. Возможно увеличение общего кровотока при сохранении высокого внутрикапиллярного давления кислорода. Этот путь очень эффективен, но нерентабелен, так как увеличение кровотока связано с усиленной работой сердца.
2. Увеличение доставки кислорода может достигаться усиленным извлечением его тканями. Это может быть осуществлено следующим образом: либо увеличением различия между интра- и экстракапиллярным давлением кислорода (парциальное давление крови и ткани) при сохранении высокого внутрикапиллярного давления кислорода, либо отклонением кривой диссоциации оксигемоглобина вправо при сохранении нормального внутрикапиллярного давления без перемещения на кривой точек артерии и вены, что является более эффективным способом доставки тканями кислорода.
3. Наконец, имеется возможность увеличения артерио-венозного различия в содержании кислорода при снижении внутрикапиллярного давления, что является крайне неэффективным в смысле адекватного потребления тканями кислорода.
В условиях патологии все эти механизмы используются одновременно, но размер их участия и значимость неодинаковы [30].

2.3. Влияние кислородной недостаточности на биохимические процессы в мышцах И ПЕЧЕНИ

Кислородное голодание встречается при многих физиологических состояниях и заболеваниях сердечно-сосудистой системы, легких, крови, отравлениях различными лекарственными препаратами и ядами, являясь первичной патогенетической основой разнообразных нарушений в организме человека. В то же время с помощью гипоксических нагрузочных проб возможно выявление скрытых или стертых течений некоторых заболеваний, преимущественно сердечно-сосудистой и нервной системы, а также оценивать и стимулировать адаптационные возможности организма [17]. В связи с этим сведения о физиологических и патологических реакциях тканей организма при кислородном дефиците представляют несомненный интерес.

2.3.1. Виды гипоксических состояний

В процессе эволюционного развития организмы приобрели эффективный способ получения энергии – биологическое окисление. У человека и высших животных окислительные реакции, протекающие с участием кислорода, — преимущественный источник энергии.

В течение многих лет для обозначения состояния кислородного голодания организма использовался термин «аноксия», этиологический смысл которого — недостаточное содержание кислорода в крови (ан – лишение, оксиген – кислород и емия – кровь). Позже вместо него стали пользоваться более удачным термином «гипоксия» (hypoxia, от греч. hypo – под). В настоящее время гипоксией (кислородной недостаточностью) называют состояние, наступающее в организме при неадекватном снабжении тканей и органов кислородом или при нарушении утилизации в них кислорода в процессе биологического окисления.

Поскольку происхождение и динамика кислородного голодания протекает по различной схеме, выделяют значительное число типов гипоксии [1]. Развитие ее классификаций, отражающее успехи изучения нарушений доставки, переноса и утилизации кислорода в тканях, позволяет терминологически правильно обозначать формы гипоксии и дает общее представление о причинах развития кислородной и энергетической недостаточности в организме. Ранние классификации построены на принципе дефектности гемоглобина как переносчика кислорода. В классификации, предложенной И.Р. Петровым (1949), предусматриваются также экзогенные и дыхательные виды гипоксии. В более поздних классификациях видов гипоксий, в частности, по А.З.Колчинской (1979), учитывались как внешние, так и внутренние изменения, происходящие на всех этапах доставки и использования кислорода [1].

Экзогенная гипоксия возникает при недостатке кислорода в окружающей среде, в результате снижается РО₂ (парциальное давление кислорода) альвеолярного воздуха и артериальной крови. Вследствие возникающей защитной реакции гипервентиляции легких наряду с артериальной гипоксией имеет место гипокапния и может проявляться газовый алкалоз.

Экзогенную гипоксию, в зависимости от изменений факторов окружающей среды, делят на три подкласса:

— гипоксическую,

— гипероксическую,

— экологическую.

По другой классификации экзогенную гипоксию делят на гипобарическую и нормобарическую.

Гипобарическая экзогенная гипоксия возникает главным образом при подъеме на высоту (Высотная болезнь, Горная болезнь), когда снижается общее атмосферное давление и, соответственно, падает парциальное давление кислорода. Нормобарическая экзогенная гипоксия развивается при нормальном общем барометрическом давлении, но сниженном парциальном давлении кислорода во вдыхаемом воздухе, например при нахождении в небольших замкнутых помещениях, работах в шахтах, колодцах, при неисправностях систем кислородообеспечения в кабинах летательных аппаратов, подводных лодках. Патогенетической основой экзогенной гипоксии является артериальная гипоксемия, т.е. уменьшение напряжения кислорода в плазме артериальной крови, приводящее к недостаточному насыщению гемоглобина кислородом и снижению его содержания в крови. Дополнительное отрицательное влияние на организм может оказывать также гипокапния, нередко развивающаяся при гипоксии в результате компенсаторной гипервентиляции легких и приводящая к ухудшению кровоснабжения головного мозга, сердца, нарушениям электролитного баланса и алкалозу.

В случае нарушения работы газотранспортных систем и системы биологического окисления возникает эндогенная гипоксия, которая может быть нескольких типов [26]:

1) дыхательная (респираторная) гипоксия возникает в результате нарушения газообменной функции легких при нормальном РО₂ в атмосферном воздухе, например, при отеке легких, пневмониях и др.;

При дыхательной гипоксии имеет место гипоксемия и возникает гиперкапния, вследствие чего к метаболическому ацидозу присоединяется газовый ацидоз; гиперкапния способствует стимуляции внешнего дыхания;

2) циркуляторная гипоксия развивается в результате расстройства кровообращения, приводящего к снижению транспорта кислорода к тканям;

3) гемическая гипоксия возникает в результате уменьшения кислородной емкости крови, которое может проявляться при снижении уровня гемоглобина или при изменении его свойств;

4) тканевая (биоэнергетическая) гипоксия развивается в том случае, если нарушается утилизация кислорода в процессе биологического окисления; ткани получают достаточное количество кислорода, однако он утилизируется менее эффективно, чем в норме [8];

5) цитотоксическая (гистотоксическая);

6) гиперметаболическая.

Необходимо отметить, что любое гипоксическое состояние – это достаточно сложный комплекс ответных реакций на гипоксический стимул, в который, как правило, включены все функциональные системы организма, в связи с чем гипоксия в большинстве случаев бывает смешанного типа. В оценке степени тяжести и скорости развития кислородной недостаточности стало обычным проводить различие между острой и хронической гипоксией. По времени протекания гипоксию принято разделять на три формы:

— молниеносную (несколько десятков секунд),

— острую (от нескольких минут до нескольких часов),

— хроническую (дни, недели, месяцы, годы) [1].

Из всех функциональных систем организма к действию острой гипоксии наиболее чувствительны центральная нервная система, а также дыхание и кровообращение [1, 10].

Известно, что в обычных условиях эффективность биологического окисления, являющегося основным источником богатых энергией фосфорных соединений, необходимых для функционирования и обновления всех биологических структур, соответствует функциональной активности органов и тканей. При нарушении этого соответствия возникает состояние энергетического дефицита, приводящее к функциональным и морфологическим изменениям, направленным вначале на формирование повышенной резистентности организма к гипоксическому воздействию, а при глубокой степени гипоксии и продолжительном периоде воздействия – к деструктивным нарушениям, вплоть до гибели организма [1,12].

Вместе с тем, в настоящее время гипоксия все чаще рассматривается как физиологическое состояние, реализующееся через адаптационные механизмы, и уверенно переходит из разряда исключительно патологических факторов в лечебно-профилактический [1].

2.3.2. Особенности метаболизма мышц и печени при гипоксии

При моделировании аноксии на тканевых образцах в общих чертах воспроизводится та же закономерность изменения потребления кислорода, что и после декапитации животного. Степень выраженности и длительности периода постгипоксической активации, необходимого для восстановления энергетической регуляции, определяется, по-видимому, периодом аноксии. Следует ожидать, что в менее жестких условиях (различные формы подострой гипоксии), когда возможно проявление и положительное влияние адаптационно-компенсаторных механизмов, характер восстановительных процессов впоследствии будет отличаться.

В условиях гипоксии изменяется динамика окислительно-восстановительных процессов в мышцах и печени. Дефицит энергии составляет суть любой формы гипоксии и обусловливает качественно однотипные метаболические и структурные сдвиги в различных органах и тканях [12]. Происходит быстрое истощение резерва кислорода, связанного с гемоглобином и миоглобином, снижается уровень субстратов окисления в тканях, повреждается структура мембран митохондрий и снижается активность митохондриальных ферментов, в результате чего нарушаются процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях и процессы транспорта АТФ из митохондрий к местам ее использования. Это приводит к снижению концентрации АТФ и креатинфосфата (КФ), накоплению продуктов метаболизма макроэргов [18]. При этом скорость снижения концентрации КФ существенно больше, чем АТФ, что обусловлено быстрым расходованием его на образование АТФ и нарушением транспорта из митохондрий. Возникающий в ткани энергодефицит ослабляет репаративные процессы, в том числе ресинтез мембран [6].

Активность креатинкиназы в мышцах и печени снижается . Вероятно, это является результатом выхода фермента в кровь. После 2-3 часовой гипоксии активность фермента возвращается к нормальному уровню, повышение активности выше нормы при острой гипоксии не наблюдается [18]. Восстановление нормального уровня КФ после воздействия кратковременной аноксии при возобновлении кровотока в миокарде происходит через 1-5 минут. Значительно медленнее возрастает содержание АТФ и ГТФ, по-видимому, из-за распада части пула пуриновых нуклеотидов. В отсутствии КФ, когда прекращается рефосфорилирование АДФ в процессе окислительного фосфорилирования, часть АТФ синтезируется из АДФ в равновесной аденилаткиназной реакции: 2АДФ-АТФ+АМФ. АМФ быстро дефосфорилируется 5′-нуклеотидазой до аденозина, который дезаминируется до инозина с последующим образованием ксантина и гипоксантина. Под действием ксантиноксидазы гипоксантин превращается в ксантин и мочевую кислоту. Генерируемые неполярные соединения проникают через клеточную мембрану и вымываются из миоцитов. Поскольку биосинтез адениннуклеотидов происходит медленно, их деградация практически необратима, и поэтому уровень АТФ и АДФ при гипоксии практически не восстанавливается [3, 10].

Известно, что при острой гипоксии происходит активация гликолиза и гликогенолиза, синтез гликогена снижается. Интенсивность гликолиза резко возрастает (в 10-20 раз) за счет активации фосфофруктокиназы и индукции ее гена. Активированный гликолиз протекает за счет расщепления глюкозы, скорость поступления которой увеличивается при аноксии. Трансмембранный перенос глюкозы часто становится в этих условиях стадией, лимитирующей скорость гликолиза [26]. Предпочтение глюкозы как субстрата окисления определяется не только регуляцией катаболических реакций, но и на уровне транкрипции.

Содержание глюкозы при гипоксии увеличивается главным образом за счет активации гликогенолиза. Активация происходит из-за повышенного в условиях гипоксии выброса катехоламинов, гормоны взаимодействуют с мембранными рецепторами, что ведет к увеличению внутриклеточного содержания ц-АМФ; ц-АМФ в свою очередь активирует протеинкиназу, а она – гликогенфосфорилазу. Вместе с тем, отмечено усиление глюконеогенеза в печени в начальной стадии гипоксии [26, 30].

Несмотря на усиление гликолиза, концентрация макроэргов падает и вскоре достигает уровня, неспособного обеспечить не только функциональную активность клетки, но и её жизнеспособность. Накопление лактата вызывает ацидоз. Ацидоз приводит к ингибированию ключевых гликолитических ферментов, в том числе фосфофруктокиназы. Из-за накопления лактата не восстанавливаются те количества НАД, которые необходимы для поддержания 3-глицерофосфатдегидрогеназной реакции. Это обстоятельство также способствует ингибированию гликолиза, скорость которого резко уменьшается в течение 20-25 мин аноксии. Продолжительная гипоксия приводит к индукции генов фосфофруктокиназы и других ферментов гликолиза.

Распад белка может служить в течение определенного времени дополнительным источником энергии, регулируя тканевый уровень аминокислот, вовлекающихся в глюконеогенез либо в реакции трансаминирования с дальнейшим включением в ЦТК, что, по-видимому, происходит при гипоксии. При этом наибольшее значение имеют аспарагиновая и глутаминовая кислоты [26].

В условиях аноксии, несмотря на ингибирование протеолиза и катаболизма большинства аминокислот, скорость деградации глутаминовой и аспарагиновой кислот увеличивается. Их деградация обусловлена сопряженным трансаминированием, приводящим к синтезу аланина, и связана с образованием α-кетоглутарата и оксалоацетата. Следствием происходящего при этом синтеза сукцината должен быть выход ГТФ и АТФ в реакциях субстратного фосфорилирования и НАДН-зависимого восстановления фумарата, что представляется существенным при блокировании аэробной энергопродукции.

В настоящее время считается, что блокирование дыхательной цепи происходит в первую очередь под действием NO (окись азота) и его производных. NO концентрация в митохондриях увеличивается в течение гипоксии. Это NO накопление обосновано работой группы NO-синтетаз, наиболее вероятный их источник, фермент-mtNOS расположенный или в пределах митохондрии или в пределах юкстамедуллярных камер эндоплазматической сети. Наведенное гипоксией увеличение NO концентрации ослабляет митохондриальное дыхание, это вызвано тем, что: NO — конкурентный ингибитор оксидазы цитохрома. Увеличение в митохондриях печени NO концентрации накопленной в пределах гипоксического периода вызывает ингибирование оксидазы цитохрома (комплекс IV дыхательной цепи). Кроме того, ONOO^—производное от NO затрудняет работу комплексов I, и V дыхательной цепи. Можно считать доказанным, что компонент блокады дыхательной цепи в уменьшение дыхания установлен исключительно для NO, который синтезируется NO-синтетазами в пределах митохондрий [23].

Литературные данные свидетельствуют о важной роли анаэробного образования сукцината при аноксических и гипоксических состояниях, а также об активации окисления сукцината (АОС) в условиях гипоксии. Оказалось, что образование сукцината в изолированных митохондриях интенсивно идет из α-кетоглутаpaтa с малатом, α-кетоглутарата с аммонием и из малата. Показано также не энзиматическое образование сукцината при АОС.

Из-за накопления молочной кислоты и других недоокисленных продуктов углеводного и жирнокислотного обменов нарастает внутриклеточный метаболический ацидоз, при котором происходит активация лизосом, усиливаются катаболизм белков, фосфолиполиз и ПОЛ, угнетается активность ряда ферментных систем, в частности креатинкиназной и антиоксидантной [18].

Одним из наиболее существенных механизмов изменений, связанных с нарушением энергетики клетки при снижении парциального давления кислорода в тканях, является активация процессов ПОЛ. В условиях гипоксии, когда концентрация АТФ в клетках снижена, кальций накапливается в цитоплазме, что приводит к активации нескольких протеаз, способствующих образованию свободных радикалов, которые окисляют липиды клеточных мембран. Фосфолипаза А2 также активируется при возрастании концентрации кальция в цитозоле. Эта липаза освобождает арахидоновую кислоту из фосфолипидов мембран [5]. Метаболизм арахидоновой кислоты дает также свободные радикалы. Если значительная часть липидного биослоя клеточной мембраны переокислена, то клетка неспособна поддерживать электролитный состав и наступает ее деструкция. Сходные реакции происходят с РНК, ДНК и с компонентами антиоксидантной системы – каталазой, глутатионпероксидазой, тиоредоксином, супероксилдисмутазой [12].

Под влиянием глубокой длительной гипоксии в плазме крови накапливаются в необычно высоких концентрациях биологически активные вещества: катехоламины, гистамин, серотонин, брадикинин. В таких концентрациях они вызывают многие патологические процессы: нарушают микроциркуляцию, увеличивают сосудистую проницаемость, вызывают нарушение обмена веществ.

Известно, что в любой популяции животных имеются особи с различной резистентностью к кислородной недостаточности [7]. Эта особенность определяется генетическими и фенотипическими свойствами организма: характером его метаболизма, степенью совершенства регуляторных механизмов, их способностью перестраиваться в гипоксических условиях в целях сохранения жизнеспособности особи и т.п.[7]. Кроме того, устойчивость к гипоксии, по-видимому, имеет половые различия: среди самок чаще встречаются особи, значительно превышающие по резистентности самцов. Индивидуальные различия в реакции на гипоксию, оцениваемые по изменению их функциональной активности, сохраняются на тканевом и клеточном уровнях. В то же время, биохимические данные свидетельствуют о том, что гипоксия является не столько патологическим процессом, а скорее всего фактором перестройки метаболизма на более низкий уровень обмена, с чем связано повышение эффективности механизмов, направленных на уравновешивание процессов синтеза и распада веществ.

Некоторые исследователи полагают, что при гипоксии реализуется 2 вида клеточных защитных механизмов: первые – это механизмы, обеспечивающие безопасность снижения содержания кислорода в разных тканях, когда происходит приспособление к метаболизму при низком содержании АТФ. Они включают блокирование многих ион-транспортных АТФаз и АТФ-зависимых каналов, приостановку синтеза наименее важных белков за счет прекращения их трансляции и ряд других изменений. В отличие от чувствительных к гипоксии клеток, где эти изменения необратимы, в клетках некоторых животных (например, черепах) в условиях длительного кислородного голодания включается другая система защиты, связанная с возобновлением синтеза белков. Но в этом случае синтезируются, в основном, специфические белки, регулирующие клеточный метаболизм таким образом, что его скорость снижается параллельно со снижением потребности клеток в кислороде [19].

Таким образом, гипоксия оказывает повреждающее действие на клетки мышц и печени. При кислородной недостаточности в этих тканях происходят изменения в углеводном и белковом обменах, а также в липидном.

2.3.3. Липидный обмен в мышцах и печени при кислородной недостаточности

При гипоксии происходят существенные изменения в метаболизме липидов. Изменения в липидном слое мембран клеток начинаются уже в первые минуты гипоксии в результате нарушение обмена ионов в клетке, увеличения в крови концентрации катехоламинов и активации ими липаз [2].

После острой гипоксии (1 ч.) содержание общих липидов в мышцах значительно снижалось. Существенные отличия обнаружены главным образом во фракциях Х и ДГ [14]. Относительная концентрация первых снижалась, вторых – возрастала. Анализ абсолютных величин отдельных фракций при гипоксии показал, что содержание большинства фракций снижалось, но в разной степени. В 2 и более раз уменьшилось количество ФЛ, Х, ТГ и СЖК, тогда как содержание ДГ и некоторых других оставалось практически неизменным. В печени также снижалось количество ФЛ и увеличивалась концентрация лизофосфолипидов и СЖК [14].

На изолированных клетках показано, что гипоксия активирует фосфолипазу А2 и приводит к накоплению лизофосфолипидов и арахидоновой кислоты. Предполагают, что при кислородной недостаточности значительно активируются эндогенные ферменты, катаболизирующие ФЛ, что приводит к нарушению белково-липидных взаимоотношений в мембранных структурах.

К гипоксическому повреждению миоцита приводит прежде всего нарушение метаболизма митохондрий [23]. В отсутствии кислорода ингибируется система β-окисления. Метаболиты ЖК — ацил-КоА и ацилкарнитин — негативно влияют на миоциты и гепатоциты при их накоплении. Увеличение содержания ацил-КоА ведет к ингибированию АТФ-АДФ-транслоказы, ацилкарнитин приводит к повреждению сарколеммы. Кроме того, при повышенной концентрации они обладают детергентным действием, образуя мицеллы, в которые начинают включаться мембранные фосфолипиды.

У неадаптированных животных при острой гипоксии концентрация СЖК в крови возрастает в 3,5 раза и больше, в мозге — в 2,5 раза, в печени — в 2,5 раза, в сердце — в 2,7 раза, в легких — в 2 раза, в мышцах — в 3 раза [3].

Увеличение содержания кетокислот при гипоксии усугубляет ацидоз, а накопление CЖК приводит к угнетению активности цАМФ-зависимой протеинкиназы, связыванию внутриклеточных ионов, разобщению биологического окисления, прогрессированию энергетического дефицита и развитию жировой дистрофии. Накопление ТГ связывается также с экспрессией некоторых генов. В аэробных условиях жирные кислоты не накапливаются.

Увеличение содержания СЖК при гипоксии может носить компенсаторно-приспособительный характер. ЖК угнетают АТФ-АДФ-транслоказу адениннуклеотидов, ответственную за перенос АТФ и АДФ через митохондриальную мембрану. Вероятно, высокий уровень СЖК препятствует расщеплению внемитохондриального фонда АТФ, что приводит к сохранению необходимого для функциональной активности количества АТФ, предохраняя клетку от полного истощения энергетических ресурсов.

ЖК – одна из основных транспортных и лабильных форм липидов, покрывающих потребность тканей в субстрате окисления во время экстремальных воздействий. ЖК являются мощным источником янтарной кислоты (ЯК), что играет весьма важную роль в поддержании функционального состояния тканей. ЯК образуется из продуктов распада ЖК, главным образом из ацетил-КоА, малонил-КоА, пропионил-КоА. Протекающие при образовании ЯК из осколков ЖК реакции карбоксилирования, транскарбоксилирования, изомеризации и расщепления не требуют НАД+. ЯК, в свою очередь, как субстрат окисления позволяет усилить энергетическую продукцию, пластические процессы, синтезы железосодержащих порфириновых дыхательных пигментов, дыхание.

Несмотря на мнение ряда авторов о приспособительном увеличении количества СЖК при гипоксии, этот вопрос является спорным. Во-первых, в экстремальных условиях, по-видимому, важнее не аккумуляция энергии, а мобилизация ее; во-вторых, β-окисление СЖК при гипоксии затруднено вследствие недостатка окислителя, поэтому СЖК в условиях гипоксии не могут быть надежным субстратом окисления.

В условиях гипоксии, даже близкой к физиологической, СЖК практически не окисляются. В этой ситуации не исключены инверсия β-окисления и утилизация в процессе синтеза ЖК в митохондриях НАДН, в избытке образуемого при гликолизе.

Содержание неорганического фосфата (Фн) при гипоксии уменьшается, что хорошо коррелирует с резким снижением абсолютного содержания ФЛ. Возможно, часть Фн, освобождающаяся при гидролизе ряда ФЛ, является источником Фн сыворотки крови, где его содержание увеличивается и не зависит от распада ФЛ сыворотки крови.

Острая гипоксия вызывает изменения в количестве отдельных ФЛ-фракций: содержание ГЛФ, ФК и ПГФ снижается, концентрация ФС и ФЭА уменьшается в меньшей степени, тогда как количество СМ увеличивается [14]. Выраженного увеличения количества лизоформ ФЛ при гипоксии не обнаруживается. Можно предположить, что в сердечной мышце существенно активируются фосфолипазы в отношении митохондриальных ПГФ и ФК, а также фосфатаза ФК, гидролизующие их до ДГ и ГЛФ. ГЛФ, образование которого в этих условиях не требует прямой затраты макроэргов типа АТФ, может использоваться в свою очередь в реакциях анаэробного гликолиза. Таким образом, в мышечной ткани при острой гипоксии ФЛ (особенно ФК и ПГФ) могут стать (после ряда подготовительных гидролитических стадий) источниками энергии в условиях сниженного аэробиоза и недостатка других источников энергии.

В печени снижение интенсивности обмена ФЛ имеет место лишь при тяжелой степени гипоксии; после хронической гипоксии ФЛ, наоборот, накапливаются, что сопровождается ростом активности митохондриальной глицерол-3-фосфат-ацилтрансферазы, причем посредством увеличения количества определенного фактора транскрипции – регулятора липогенеза. Есть данные об усилении всех путей липидного метаболизма печени в условиях гипоксии. Показано также, что хроническая гипоксия угнетает утилизацию стеролов в печени и синтез холестерина на уровне транскрипции, что считается механизмом высотной акклиматизации, так как изменения содержания Х после гипоксии в печени и плазме могут не обнаруживаться. В неонатальный период в печени крыс отмечено повышение содержания ТГ и ДГ в условиях хронической гипоксии и снижение активности печеночной липазы, в постнатальный период после 10-минутной аноксии – увеличение ДГ.

Гипоксия ослабляет синтез и усиливает распад жиров, в результате чего жирные кислоты накапливаются в тканях, а кетокислоты – в крови. Так, количество ацетона в крови у человека и животных после 6-часового пребывания на «высоте» 6000 м возрастает на 10-30% против исходных величин [29]. Последнее связано с тем, что при недостатке кислорода нарушается утилизация продуктов жирового обмена в ЦТК.

Существуют данные об устойчивости липидов микросомальных мембран печени к оксидативному стрессу.

Известно, что устойчивость к гипоксии в высокой степени генетически детерминирована, что подтверждается также различной реакцией и со стороны метаболизма липидов высоко- и низкоустойчивых к гипоксии животных. У ВУ-животных через 2 недели после однократной кратковременной гипоксии отмечались признаки, характеризующие модификацию вязкости мембран: убыль ФХ и ФЭА, замена их лизоформами, а также замена ФХ на СФМ. У НУ-животных к этому времени сохранялись изменения ФЛ состава, характерные для поддержания клеточных структур в возбужденном состоянии: увеличение в мембранах источников вторичных мессенджеров – ФИ и кальциевого ионофора – ФК. Поскольку изменения фосфолипидного компонента мембран самым непосредственным образом влияют на вязкость, проницаемость, передачу внешних сигналов внутрь клетки и, следовательно, на их функции, представляется возможным оценить выявленные различия фосфолипидного состава мембран низко- и высокоустойчивых животных как различную липидную стратегию организации приспособления их к гипоксии.

Таким образом, гипоксия приводит к существенным изменениям липидного обмена мышц и печени.

2.4. Посмертные биохимические изменения липидов мышечной ткани и печени

Гибель любого организма представляет собой длительный и сложный процесс, характеризующийся неодинаковой временной продолжительностью для различных биологических структур. Установлено, что смерть тканей и органов происходит позднее смерти организма. При умирании организма жизненные функции теряются, в основном, в соответствии с их филогенетическим возрастом: более молодые – раньше, более старые – позднее.

Одним из основных механизмов посмертных изменений тканей организма является аутолиз (от греческого autos – сам и lysis – разложение, распад). Данные термин был введен в 1900 – 1903 гг. Jacoby, установившем как посмертный, так и прижизненный характер аутолиза, происходящий ферментативным путем во всех органах. В 1974 г. Лушников и Шапиро дали определение аутолизу как выработанному в процессе эволюции свойству биологических объектов разрушать гидролитическим путем собственные структуры разного уровня [20]. Сегодня аутолиз можно определить, как выработанное в процессе эволюции свойство биологических объектов разлагать ферментативными и неферментативными путями собственные структуры разного уровня с преимущественным участием гидролазных, а также трансферазных и других реакций биодеградации и биотрансформации их молекулярных компонентов. Исследование аутолиза имеет важное прикладное значение в различных областях экспериментальной биологии и медицины, особенно для теории и практики консервации и трансплантации органов и тканей, реанимации, в геронтологических, судебно-медицинских и других исследованиях.

Период завершения существования биологического объекта сложно определить; некоторые исследователи условно разделяют на три этапа: умирание, аутолиз и финальная деструкция [20].

Этап умирания соответствует клинической смерти в реаниматологии. На последующем этапе аутолиза синтетический потенциал клеток тканей снижается и возрастает скорость деструктивных процессов. Во время третьего этапа – финальной деструкции – в разрушении биологического объекта начинают приобретать все возрастающее значение и внешние факторы: действие микроорганизмов, окисление, высыхание и т.п. Однако реально провести границу между отдельными этапами, оценивая состояние какого-либо объекта, особенно между первым и вторым этапом весьма сложно.

Аутолитические процессы сопровождают большинство физиологических и паталогических реакций. Некоторые представления об участии аутолиза в разнообразных биологических процессах дает следующий рис. 1.

Рис. 1. Схема участия аутолиза в ряде биологических процессов [20]

Свертывание крови

и фибринолиз

Внутриклеточное Имунные

переваривание реакции

Образование Распад и образование

свободных Аутолиз гормонов

аминокислот

Атрофия и Смерть Некроз

дистрофия организма

Выделяют несколько принципиальных особенностей аутолиза, которые отличают его от таких биологических явлений, как фагоцитоз, некроз, апоптоз, имеющих сходные (гидролитические) механизмы развития:

1. Принцип эволюционизма, заключающийся в том, что это явление имеет свои исторические корни появления на протяжении всей жизни организма, и после смерти (прижизненный и посмертный аутолиз).

2. Принцип ферментативного гидролиза, отличающий его от распада (катаболизма), происходящего при участии окислительных и других ферментов. Хотя следует подчеркнуть, что нельзя исключать и другие ферментативные и неферментативные процессы.

3. Принцип поликомпонентного распада, свидетельствующий о том, что при аутолизе за счет большого набора лизосомных ферментов и других структур осуществляется одновременный распад многих веществ (белков, липидов, углеводов и пр.).

4. Принцип гетерохронии, определяющий разновременность разрушения органов, тканей, клеток, их ультраструктур после смерти.

Смерть клетки запаздывает по отношению к смерти организма, и время этого “запаздывания” неодинакова в различных органах и тканях. Смерть клетки считают постепенно протекающим процессом, до известной степени повторяющим стадии смерти организма. При смерти от аноксии, например, гибель клеток слагается из четырех этапов: обратимых изменений, необратимых изменений (момента смерти), преднекротического периода и посмертных изменений (некроз), ведущих к клеточному распаду [20].

Аутолиз отдельных органоидов клетки может развиваться прижизненно по отношению к клетки в целом, и клетка продолжает свою жизнедеятельность. Как по отношению к смерти организма, так и по отношению к клеточной смерти, аутолиз в большинстве случаев начинается еще в период обратимых изменений, то есть еще до момента смерти клетки или наступления биологической смерти организма.

В ряде случаев имеется генетическая обусловленность процессов распада молекулярных компонентов через активацию или ингибирование соответствующих ферментных систем клеток и их структур. Иными механизмами умирания являются программированная клеточная гибель (ПКГ) и апоптоз, однако аутолитические реакции вносят некоторый вклад в деградацию клетки независимо от того, носит ли ее гибель программированный или непрограммированный (случайный или патологический, например, некроз) характер. Ключевым механизмом некроза и аутолиза является деструкция мембранных систем клетки, а ПКГ и апоптоза — активация эндонуклеаз, приводящая к гидролизу ДНК, появлению танатинов и т.п.

Разрушение клеточного уровня организации живых систем осуществляется путем дезинтеграции, деградации молекул и надмолекулярных структур, однако оно сопровождается биотрансформацией, частичными катаболическими превращениями, трансацилированием и др.

Ультраструктурные изменения в различных тканях сходны (отек клеток, морфологические изменения хроматина и внутреннего содержимого митохондрий, исчезновение гранул гликогена), но специфично время их развития. В сравнении, нервная ткань, эпителии, кровь обнаруживают ранние биохимические и морфологические признаки умирания. Изучение посмертных аутолитических изменений почек, поджелудочной железы, печени, сердца и мышц крыс на общей инкубационной модели показало, что наибольшей была устойчивость к посмертным изменениям у скелетной мускулатуры и наименьшей – у почек, в гепатоцитах изменения обнаруживались раньше, чем в миокарде [20]. Выявлено, что посмертная инкубация приводит к различным видам ультраструктурных изменений ядерного содержимого, характерных как для апоптоза, так и для гидролитической аутолитической деградации, то есть при переживании в условиях инкубации могут реализоваться оба механизма. Известно, что факторы, предшествующие переживанию ткани, влияют на активность того или иного механизма. Так гипоксия индуцирует апоптоз переживающих гепатоцитов.

К настоящему времени проведено значительное число исследований аутолитических изменений липидного компонента в различных органах и тканях (печень, миокард, сыворотка крови, эндокринные органы), а также в их некоторых ультраструктурах (ядрах, МТХ, лизосомах, микросомах). Установлено, что характер аутолитических преобразований липидного компонента в различных органах, тканях и их ультраструктурах имеет в своей основе не только гидролитические механизмы, связанные с активацией липолитических ферментов, но и другие реакции биотрансформации, включая рециклинг (повторное использование) ЖК и образование реципрокных пар и триад (рис. 2).

ЛФЛ

ФХ

СФМ

ЛФЭА

ФЭА

ЛФС

ФС

ГЛФ

ФК

ПГФ

ДГ

Фн

ЖК

, а также

Рис. 2. Схема образования реципрокных пар и триад при аутолизе.

В аутолизирующейся ткани отмечен гидролиз триглицеридов, а также фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина с одновременным увеличением соответствующих лизоформ и жирных кислот вследствие повышенной активности триглицеридлипазы и фосфолипаз А2 и А1.

При исследовании посмертных превращений липидов сердца цыплят отмечалась активация фосфолипазы А2 и сфингомиелиназы, деацилирование кардиолипина и плазмалогенов этаноламина, накопление церамидов. Такими же были изменения в сердце крыс, причем вне зависимости от возраста использованных животных.

ФЛ

ТГ

ДГ

СЖК (общий пул)

ЭХ

Рис. 3. Общая схема возможных взаимоотношений отдельных липидных фракций при посмертном аутолизе.

Специфика некротического процесса в тканях проявляется на уровне регуляции липидного обмена. Так, в здоровом сердце СЖК подавляют потребление глюкозы, а при ишемическом повреждении – нет. При экспериментальной ишемии и посмертной инкубации обнаруживается увеличение количества миокардиального ЖК-связывающего белка уже через 15 мин после ишемии, и его уровень остается повышенным еще 48 ч после смерти . Инкубация кардиомиоцитов с пальмитатом показала незначительное по сравнению с другими тканями его включение в состав ТГ и ФЛ [24].

Среди факторов, также оказывающих влияние на ход аутолитических изменений липидного компонента в различных тканях, можно выделить острую гипоксию. Выявлено, что предшествующее острое гипоксическое воздействие ускоряет гидролиз ФЛ (но не ТГ) в аутолизирующейся ткани надпочечников, ткани и гомогенате семенников с увеличением количества СЖК, ЭХ – в не эндокринных тканях и нейтральных липидов – в органах, продуцирующих стероиды . В этих условиях среди ФЛ аутолизирующихся тканей отмечено снижение ФХ, ПГФ, а также ФК, ФС (надпочечники, семенники), СФМ (миокард) с одновременным возрастанием ГЛФ, ФЭА, но не ЛФЛ, что указывает на различия в механизмах аутолитической деградации ФЛ. В большинстве ультраструктур органов снижалось количество холинсодержащих фракций. Родовая гипоксия вызывала деградацию фосфолипидного компонента мембран кардиомиоцитов путем активации фосфолипазы А2 [24].

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что предшествующая кислородная недостаточность оказывает существенное влияние на аутолитические перестройки липидов мышц, миокарда, печени, сыворотки крови и некоторых эндокринных органов и их биологических структур разного уровня. При гипоксии в динамике аутолиза усиливается гидролиз некоторых фракций ФЛ, изменяется хроматографическая подвижность отдельных фракций ФЛ, а в ряде случаев происходит образование рекомбинантных молекул, более устойчивых к последующему гидролизу. Инкубация лизосом печени при рН = 5 сопровождалась уменьшением количества триглицеридов ФХ, ФЭА, сфингомиелина за счет увеличения активности триглицерид-, сфингомиелинлипаз, фосфолипаз, но содержание ФИ при этом не менялось.

III. Материалы и методы исследования

3.1. Объекты исследования

Опыты проводили на земноводных Rana sp на базе лаборатории кафедры биомедицины ТвГУ, было использовано 5 животных. Для исследования посмертных изменений липидов были выбраны модели инкубации in vitro в среде стерильного физиологического раствора и модель in situ postmortem (экспозиция тушки без предварительного выделения образцов ткани). В качестве объектов были выбраны печень и мышцы – ткани, адаптированные к гипоксии и способные к переживанию организма, но различные по значению липидного обмена. Для исследования влияния кислородных условий переживания тканей на посмертные изменения липидов была использована аноксическая и нормоксическая среда инкубации.

3.2. Получение опытного материала, выделение и инкубирование образцов

Для инкубации брали изолированные образцы печени и мышц. После взвешивания (на электронных весах) либо сразу экстрагировали липиды (0ч, исходные значения), либо навески тканей помещались в 1 мл среды для инкубации в открытую пробирку. В качестве кислородной среды использовался физиологический раствор, насыщенный О₂, в качестве бескислородной среды физиологический раствор, предварительно прокипяченный с последующим остужением до комнатной температуры в стекле под полиэтиленовой крышкой , без доступа воздуха). Образцы тканей инкубировались в течение 1 ч и 24 ч при комнатной температуре. Один образец ткани анализировался через 1 ч и 24 ч экспозиции без изоляции, in situ.

Выбор указанных сроков был обусловлен следующими причинами:

а) 0 мин – приближенное к исходному на момент смерти состоянию тканей;

б) 1 ч — срок, недостаточный для насыщения среды инкубации диффузией из атмосферы; возможно переживание ткани в течение этого времени и сохранение некоторых функциональных свойств;

в) 24 ч – развитие глубоких деструктивных процессов в тканях, срок, достаточный для насыщения кислородом среды инкубации.

После инкубации в тканевых образцах определяли содержание общих липидов и отдельных липидных фракций.

3. 3. Методы анализа липидов

3. 3. 1 Получение и очистка общего липидного экстракта

Экстракцию липидов из образцов миокарда проводили по Bligh E., Dyer W.A. [32]. Выбор данного метода для экстракции и очистки липидов был обусловлен его оптимальностью (благодаря поэтапному использованию растворителей с различной степенью полярности) для экстракции липидов из биологических структур, находящихся в водном растворе. Для этого к 1 мл среды инкубации с находящейся в ней навеской ткани добавляли экстрагирующую смесь (хлороформ, метанол в соотношении 1:2 по объему), гомогенизировали и выдерживали не менее 2 ч на холоде, периодически перемешивая. После экстракции осадок тканевых элементов отделяли фильтрованием. Затем добавляли хлороформ (в отношении 2,5:9 к количеству экстрагирующей смеси), смешивали и вносили такой же объем 0,02 % раствора хлорида кальция для удаления нелипидных примесей. Смесь хорошо перемешивали и оставляли стоять в холодильнике на сутки для расслоения фаз. Верхнюю водную фазу декантировали с помощью микродозатора. Полученный общий липидный экстракт использовали для дальнейшего качественного и количественного анализа липидов: брали аликвоты для количественного определения общих липидов –

ОЛ — 0,1 или 0,2 мл.

Оставшийся экстракт выпаривали и использовали для анализа липидных фракций.

3.3.2 Анализ общих липидов и их отдельных фракций

а) Количественное определение содержания общих липидов. Определение содержания общих липидов проводили методом разложения с серной кислотой. Для этого 0,1 и 0,2 мл общего липидного экстракта переносили в чистые пробирки и упаривали досуха при температуре 35-40⁰С. К высушенным пробам добавляли 2 мл концентрированной серной кислоты (H₂SO₄) и нагревали в специальном металлическом блоке при температуре 190-200⁰С в течение 15-20 мин. Охлажденные пробы осторожно разводили 2 мл дистиллированной воды, перемешивали и определяли (после охлаждения) оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм для ОЛ в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм. Содержание общих липидов в пробах рассчитывали, пользуясь предварительно построенными калибровочными графиками.

Содержание ОЛ в пробах (в мг% на сырой вес ткани) рассчитывали по формуле [12]:

, где:

мкг ОЛ — количество ОЛ в пробе, мкг;

V_общ — общий объем липидного экстракта, мл;

m_тк — вес ткани, мг;

V_ан— объем общего липидного экстракта, взятый для анализа, в мл;

100 — пересчетный коэффициент для выражения ОЛ в мг%.

б) Микроанализ липидных фракций с помощью микротонкослойной хроматографии. Фракционирование общих липидов проводили с использованием метода микротонкослойной хроматографии на силикагеле. Для этого общий липидный экстракт упаривали досуха при температуре не выше 35-40⁰С и растворяли в 0,1 мл хлороформа. Полученный раствор служил исходным для проведения МТСХ.

Микротонкослойную хроматографию (МТСХ) проводили на стеклянных пластинках размером 5 х 7,5 см. В качестве носителя использовали силикагель "Л" или "ЛС" "Хемапол" (ЧССР) из расчета 20-30 мг на 1 см ² площади пластины. Нанесение сорбента осуществляли методом осаждения его из хлороформа, что значительно сокращало время приготовления пластин. Для получения ровного слоя носителя силикагель взбалтывали в 8 — 10 мл хлороформа и выливали в установленную горизонтально чашку Петри со стеклянной пластинкой на дне.

После осаждения силикагеля и испарения хлороформа пластинки высушивали на воздухе в течение 10-15 мин. Слой силикагеля на пластинке разделяли скальпелем на 3-4 дорожки. Затем на каждую из них наносили 0,03-0,05 мл упаренного хлороформного экстракта липидов на расстоянии 0,3-0,5 см от края пластинки. После подсушивания на воздухе проводили разделение в системе растворителей: гексан-диэтиловый эфир-метанол-ледяная уксусная кислота в соотношении 9:2:0,2:0,3 по объему.

В качестве камеры для разделения использовали чашки Петри, на дно которых для поддержания пластинки помещали стеклянные стержни. Систему для хроматографии (объем 11,5 мл) вносили в камеру для ее насыщения за 10-15 мин до разделения. Подведение системы растворителей к пластинке осуществляли с помощью бумажного фитилька, очищенного от липидных примесей. Время прохождения растворителей до края пластинки составляло 5 — 7 мин, после чего осуществляли проток растворителя еще в течение 5 мин.

По окончании разгонки пластинку вынимали, сушили на воздухе и проявляли в парах йода. Для этого пластинку переносили в чашку Петри, на дно которой помещали несколько кристалликов йода. Отдельные классы липидов при этом определялись в виде желтоватых пятен на белом фоне в следующем порядке от места нанесения (старта):

— фосфолипиды (на старте),

— диацилглицерины,

— холестерин,

— свободные жирные кислоты,

— триацилглицерины,

— эфиры холестерина.

Идентификацию липидов проводили с помощью известных значений длины пробега (Rf), которые составляют для ФЛ –0; ДГ – 0,05; ХС – 0,12; СЖК – 0,26; ТГ – 0,55; ЭХ – 0,8 (35) (рис.7).

Контуры проявленных фракций очерчивали иглой и пластины оставляли на воздухе до исчезновения йода. Затем механическим путем фракции переносили (счищали) в пробирки. Элюирование (перевод липидов с силикагеля в раствор) фракций ДГ, CX, СЖК, ТГ, ЭХ проводили смесью хлороформа с метанолом (2:1 по объему), а ФЛ — смесью хлороформ-этанол-уксусная кислота (2:1:0,1 по объему). Двукратное элюирование практически полностью извлекает сорбированные липиды. После элюирования пробы отфильтровывали во вторую серию пробирок.

Количественное определение отдельных фракций проводили методом сжигания с концентрированной серной кислотой (см. "Количественное определение общих липидов"). После охлаждения определяли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм для отдельных липидных фракций (ФЛ, ДГ, ХС, СЖК, ТГ и ЭХ) в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм. Содержание отдельных липидных фракций в пробах рассчитывали, пользуясь предварительно построенными калибровочными графиками. После определения количественных значений каждой фракции рассчитывали содержание отдельных видов липидов в % от суммы фракций.

3. 4. Статистическая обработка результатов исследований

Данные обрабатывали методом вариационной статистики по соответствующим биометрическим алгоритмам с использованием критерия Стьюдента [27].

Формулы для расчетов:

где: M(x) — среднее арифметическое значение;

n–число исследований;

х–единичное значение;

m–средняя ошибка средней арифметической;

t–показатель существенной разницы.

Достоверными считали различия между сравниваемыми величинами при P<0,05; P<0,01 и P<0,001. Статистическую обработку проводили с использованием ПЭВМ по стандартным программам.

IV. Результаты и их обсуждение

В данном разделе изложены предположения о причинах изменений содержания липидов и их фракций в печени и мышцах, экспериментально выявленных в ходе инкубации тканей в различных условиях.

На табл. №№ 1-16 представлены результаты анализа липидного состава мышц и печени лягушек, а также содержание липидов в препаратах этих тканей, инкубированных в различных условиях в течение 1 часа и 24 часов – в бескислородной и в насыщенной кислородом среде (печень и мышцы), а также результаты анализа липидного состава мышечной ткани, экспонированной in situ после забоя лягушек.

Эксперимент №1

Таблица 1

Содержание липидных фракций мышечной ткани в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда, неизолированная ткань)

в % от суммы фракций	Условия/фракции	м(0)	м(1)О₂	м(1)к	м(24)О₂	м(24)к	Т(1)	Т(24)
ФЛ	21,17	14,93	18,66	19,34	19,33	14,47	13,99
Х	18,00	18,71	15,78	18,97	12,64	16,55	15,80
СЖК	17,34	21,84	20,55	27,49	19,05	23,99	26,79
ТГ	25,16	19,38	18,89	19,25	16,68	19,76	17,72
ЭХ	18,33	25,13	26,12	14,95	32,30	25,22	25,69

Таблица 2

Содержание липидных фракций печени в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда)

	Условия/фракции	п(0)	п(1)О₂	п(1)к	п(24)О₂	п(24)к
в % от суммы фракций	ФЛ	24,40	25,09	24,85	29,61	29,25
Х	14,24	13,72	13,54	16,44	16,18
СЖК	22,43	24,03	23,70	28,77	28,30
ТГ	23,21	21,69	22,63	25,18	26,27
ЭХ	15,71	15,47	15,27	15,06	15,44

Таблица 3

Содержание общих липидов мышечной ткани в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда, неизолированная ткань)

ОЛ (мг%)	0ч.	1ч.	24ч.
Т	1680,60	1307,13	1419,17
м (О₂)	1344,48	1643,25
м (К)	1587,23	1643,25

Таблица 4

Содержание общих липидов печени в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда)

ОЛ (мг%)	0ч.	1ч.	24ч.
п(О₂)	2950,39	2651,61	2502,23
п(к)	2651,61	2614,27

Примечание:

м – тканевый образец мышц, п – тканевый образец печени, Т – экспозиция неизолированной ткани, к – бескислородная среда, О₂ – насыщенная кислородом среда

Эксперимент №2

Таблица 5

	условия/фракции	м(0)	м(1)О₂	м(1)к	м(24)О₂	м(24)к	Т(1)	Т(24)
в % от суммы фракций	ФЛ	24,30	20,85	19,06	19,49	19,75	18,38	16,25
Х	15,23	15,15	15,57	16,73	15,33	16,82	16,82
СЖК	16,59	20,33	22,30	24,24	26,00	24,38	28,52
ТГ	24,90	22,78	22,45	21,97	20,23	20,09	18,87
ЭХ	18,99	20,89	20,62	17,58	18,70	20,33	19,54
	условия/фракции	п(0)	п(1)О₂	п(1)к	п(24)О₂	п(24)к
в % от суммы фракций	ФЛ	16,28	13,66	13,08	12,72	12,73
Х	21,60	23,92	24,47	25,61	25,07
СЖК	21,11	21,59	22,36	21,92	22,75
ТГ	16,10	15,40	15,09	15,44	15,10
ЭХ	24,90	25,43	25,01	24,32	24,35

Таблица 7

ОЛ (мг%)	0ч.	1ч.	24ч.
Т	1527,19	1349,61	1349,61
О₂	1349,61	1669,25

Таблица 8

Содержание общих липидов печени в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда)

ОЛ(мг%)	0ч.	1ч.	24ч.
О₂	2770,24	2415,08	2379,57
К	2521,63	2415,08

Примечание:

м – тканевый образец мышц

п – тканевый образец печени

Т – экспозиция неизолированной ткани

к – бескислородная среда

О₂ – насыщенная кислородом среда

Эксперимент №3

Таблица 9

	условия/фракции	м(0)	м(1)О₂	м(1)к	м(24)О₂	м(24)к	Т(1)	Т(24)
в % от суммы фракций	ФЛ	19,88	14,89	20,26	18,60	22,91	14,99	14,66
Х	16,90	19,47	17,14	18,24	17,34	17,15	16,56
СЖК	18,61	21,78	22,31	26,43	22,58	24,85	28,08
ТГ	25,25	22,37	20,51	18,51	19,77	20,48	18,57
ЭХ	19,36	21,48	19,77	18,21	17,40	22,53	22,12

Таблица 10

Содержание липидных фракций печени в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда)

	Условия/фракции	п(0)	п(1)О2	п(1)к	п(24)О2	п(24)к
в % от суммы фракций	ФЛ	24,95	25,09	25,31	25,07	25,09
Х	15,10	13,72	13,48	13,91	13,56
СЖК	21,62	24,03	24,14	24,35	24,28
ТГ	22,34	21,69	21,51	21,32	21,75
ЭХ	15,99	15,47	15,55	15,35	15,31

Таблица 11

ОЛ (мг%)	0ч.	1ч.	24ч.
Т	1738,86	1267,92	1449,05
О2	1557,73	1485,28
К	1648,29	1557,73

Таблица 12

Содержание общих липидов печени в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда)

ОЛ (мг%)	0ч.	1ч.	24ч.
О2	2572,06	2427,16	2246,03
К	2499,61	2390,93

Примечание:

м – тканевый образец мышц

п – тканевый образец печени

Т – экспозиция неизолированной ткани

к – бескислородная среда

О₂ – насыщенная кислородом среда

Эксперимент №4

Таблица 13

	условия/фракции	м(0)	м(1)О₂	м(1)к	м(24)О2	м(24)к	Т(1)	Т(24)
в % от суммы фракций	ФЛ	21,17	14,93	18,66	19,34	19,33	14,47	13,99
Х	18,00	18,71	15,78	18,97	12,64	16,55	15,80
СЖК	17,34	21,84	20,55	27,49	19,05	23,99	26,79
ТГ	25,16	19,38	18,89	19,25	16,68	19,76	17,72
ЭХ	18,33	25,13	26,12	14,95	32,30	25,22	25,69

Таблица 14

ОЛ (мг%)	0 ч.	1 ч.	24 ч.
Т	1614,04	1255,37	1362,97
О2	1398,84	1578,17
К	1524,37	1578,17

Примечание:

м – тканевый образец мышц

п – тканевый образец печени

Т – экспозиция неизолированной ткани

к – бескислородная среда

О₂ – насыщенная кислородом среда

Эксперимент №5

Таблица 15

Содержание липидных фракций мышечной ткани в различных условиях

(бескислородная среда, насыщенная кислородом среда, неизолированная ткань)

	условия/фракции	м(0)	м(1)О₂	м(1)к	м(24)О₂	м(24)к	Т(1)	Т(24)
в % от суммы фракций	ФЛ	24,56	20,80	20,24	19,84	19,93	20,04	18,30
Х	16,70	17,38	16,35	17,84	16,51	17,73	17,09
СЖК	18,39	22,99	22,30	26,13	26,44	23,46	27,54
ТГ	23,35	17,99	20,49	18,30	21,78	18,36	18,21
ЭХ	17,01	20,84	20,62	17,89	15,34	20,41	18,86

Таблица 16

ОЛ (мг%)	0 ч.	1 ч.	24 ч.
Т	1630,18	1267,92	1376,60
О₂	1412,82	1593,96
К	1539,62	1593,96

Примечание:

По результатам отдельных экспериментов рассчитаны средние значения и отклонения от среднего, проведено сравнение средних показателей – с начальным состоянием ткани (до инкубации или экспозиции), между препаратами с одинаковыми сроками инкубации, но в среде с различным содержанием кислорода, и между инкубированными и экспонированными препаратами.

Таблица 17

Изменение содержания липидных фракций мышечной ткани в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда, неизолированная ткань)

	условия/фракции	м (0ч.)	м(1ч.) О₂	м (1ч.) к	м(24ч)О₂	м (24ч) к	Т (1ч.)	Т (24ч)
в % от суммы фракций	ФЛ	22,22±2,09	17,28±3,24	19,37±0,82	19,33±0,45	20,25±1,51°	16,47±2,58	15,44±1,85*
Х	16,96±1,14	17,88±1,71	16,13±0,64	18,15±0,93	14,89±2,18	16,96±0,49	16,42±0,59
СЖК	17,66±0,83	21,76±0,94*■	21,60±0,96*	26,35±1,33*	22,62±3,59*	24,13±0,52*	27,55±0,77*
ТГ	24,76±0,80	20,38±2,09	20,25±1,47*	19,46±1,47*	19,03±2,27*	19,69±0,80*	18,22±0,51*
ЭХ	18,40±0,90	22,70±2,24	22,65±3,19	16,72±1,63	23,20±8,39	22,74±2,43	22,38±3,26

Рис. 1. Влияние различных условий инкубации на состав липидных фракций мышечной ткани.

Примечание: различия достоверны по сравнению (р<0,05) :*- с 0 ч., • — со средой, насыщенной кислородом м (1ч.)О₂, °- с in situ(24ч.), ■ – с in situ (1 ч.).

Таблица 18

Изменение содержания липидных фракций печени в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда)

		п (0ч.)	п (1ч.) О₂	п (1ч.) к	п (24ч.) О₂	п (24ч.) к
в % от суммы фракций	ФЛ	25,11±0,76	25,21 ±0,20	25,06 ±0,23	26,33 ±2,87	26,23 ±2,64
Х	15,10±0,86	13,70 ±0,04	13,37 ±0,25	14,36 ±1,90	14,16 ±1,80
СЖК	21,96±0,42	23,99 ±0,06٭	24,10 ±0,39٭	26,24 ±2,28٭	25,88 ±2,13٭
ТГ	22,22±0,86	21,66±0,06	22,17±0,58	22,81±2,08	23,59±2,38
ЭХ	15,62±0,66	15,45±0,04	15,30±0,24	10,26±8,89	10,14±8,78

Рис. 2.Влияние различных условий инкубации на состав липидных фракций печени

Примечание: различия достоверны по сравнению (р<0,05) :*- с 0 ч.

Таблица 19

Изменение содержания общих липидов мышечной ткани в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда, неизолированная ткань)

ОЛ (мг%)

0 ч.

1 ч.

24 ч.

1638,17±78,90

1289,59±38,80*

1376,99±26,11*

О₂

1412,69±86,40

1593,98±70,99

1568,89±50,13

1580,06±43,26■

Примечание:

м – тканевый образец мышц, п – тканевый образец печени, Т – экспозиция неизолированной ткани, к – бескислородная среда, О₂ – насыщенная кислородом среда;

различия достоверны по сравнению (р<0,05) :*- с 0 ч., ■ – с in situ (24ч.)

Рис. 3. Влияние различных условий инкубации на состав общих липидов мышечной ткани

Таблица 20

Изменение содержания общих липидов печени в различных условиях (бескислородная среда, насыщенная кислородом среда)

ОЛ (мг%)	0 ч.	1 ч.	24 ч.
О₂	2781,56±158,35	2497,95±133,21	2375,94±128,14٭
К	2557,62±82,14	2473,43±122,57

Примечание:

различия достоверны по сравнению (р<0,05) :*- с 0 ч.

Рис. 4. Влияние различных условий инкубации на состав общих липидов печени

Как показали исследования, содержание ОЛ в печени лягушки составило в среднем 2782 мг%, но в ходе инкубации снижалось на 7-10% от начальной величины (таблица 20). Более выраженное в среднем снижение уровня ОЛ отмечено в образцах печени, инкубированных в среде, насыщенной кислородом, но данное отличие от бескислородных изначально условий не достигло статистически достоверных величин. Однако тенденция к снижению уровня ОЛ в препаратах, инкубированных в течение суток в насыщенной кислородом среде, по сравнению с начальным уровнем подтверждается статистически, тогда как для препаратов после суточной инкубации в изначально бескислородной среде она отмечается только в среднем. Поскольку снижение содержания липидов выявляется на раннем сроке и не исчезает через сутки, оно, вероятно, связано с более значительной деградацией липидов на начальном этапе переживания ткани, связанной с отсутствием ограничения аэробного катаболизма.

Содержание отдельных фракций общих липидов печени было довольно стабильным на протяжении инкубации в обеих средах, статистически достоверные различия касались только одной фракции – СЖК (таблица 18). Доля СЖК возросла уже после часа инкубации образцов как в условиях бескислородной среды, так и при помещении тканевых препаратов в насыщенную кислородом среду. Повышенным относительное количество СЖК по сравнению с начальным уровнем сохранялось и после суток инкубации in vitro. Увеличение содержания СЖК в ходе инкубации может объясняться гидролитическим распадом мембранных и запасных липидов с участием липаз и фосфолипаз (рис. 2).

В мышцах изменение содержания ОЛ при кислородных и бескислородных условиях инкубации в среднем подчинялось тем же закономерностям, что и в образцах печени (таблица 19). При нахождении мышечных препаратов в обескислороженной перед инкубацией среде количество ОЛ оставалось без статистически подтвержденных изменений через 1 ч и 24 ч, хотя в среднем обнаруживалась тенденция к снижению содержания ОЛ. При инкубации образцов мышечной ткани в среде, насыщенной кислородом, уровень общих липидов снижался более явно, достигая статистически значимо более низких величин по сравнению с начальными значениями. Та же тенденция и статистическая достоверность отмечались при экспозиции мышц in situ, и в этом случае средние величины содержания ОЛ были меньше, чем во всех экспериментах in vitro.

Анализ относительного содержания отдельных фракций липидов мышечной ткани показал, что наиболее стабильными в ходе инкубации были свободный и этерифицированный холестерин, не обнаружившие в среднем статистически значимых изменений (таблица 17). Изменений содержания ФЛ также не отмечались практически во всех экспериментах, а ТГ и СЖК, напротив, подвергались количественным изменениям in situ и in vitro. В образцах мышц, инкубированной в кислородной среде, через час возрастало содержание СЖК, а после суточной инкубации увеличение количества СЖК сопровождалось снижением уровня ТГ, что указывает на преимущественную активность липаз. В мышечных препаратах, инкубированных в изначально бескислородной среде в течение часа, отмечалось падение начального уровня ТГ в сочетании с увеличением содержания СЖК, показывая более раннюю активацию липаз, чем в кислородной среде. После 24 ч инкубации в той же среде уровень ТГ оставался пониженным. Сходные изменения обнаруживались при часовом выдерживании in situ, а после суток в таких условиях в мышечной ткани снижалось содержание не только ФЛ, но и ТГ на фоне повышения СЖК, указывая на наиболее глубокие деструктивные изменения, развивающиеся под действием липаз и фосфолипаз. При сравнении различных экспериментальных условий по количественному составу фракций не обнаруживаются различия между инкубированными мышечными образцами, но существенно отличаются результаты эксперимента in vitro и in situ. Так, после часовой посмертной инкубации in vitro в мышечной ткани остается больше ТГ независимо от начального содержания кислорода в среде, а при условии бескислородного начала инкубации через 24 часа в препарате мышцы остается больше ФЛ, чем in situ (рис. 1).

Таким образом, степень посмертной деградации липидов зависит от выбора модели инкубации, причем среда с низким содержанием кислорода замедляет разрушение липидов как в препаратах печени, так и в препаратах мышцы лягушки. Однако гипоксические условия in situ приводят к наиболее выраженной деградации запасных липидов и накоплению продуктов их распада. Выявленные закономерности необходимо учитывать при планировании условий переживания тканей в эксперименте и при трактовке результатов исследований с использованием подобного моделирования. Особенности изменений липидного компонента при различной степени насыщенности среды кислородом могут использоваться как аналитический компонент в исследовательской работе.

V. ВЫВОДЫ

1. После суточной инкубации in vitro в среде, насыщенной кислородом, содержание ОЛ в образцах печени и мышечной ткани снижалось по сравнению с начальным уровнем.

2. Инкубация in vitro приводила к увеличению содержания СЖК и уменьшению количества ТГ в мышечной ткани через 1 час при аноксических условиях и через 24 ч в нормоксической среде, в печени – к увеличению уровня СЖК при всех исследованных условиях.

3. В мышечной ткани после экспозиции in situ отмечено снижение уровня ТГ и накопление СЖК через 1ч, а также уменьшение содержания ФЛ и ОЛ через 24 часа.

4. В модели посмертных изменений in situ была более выражена гидролитическая деградация липидного компонента мышечной ткани, чем в модели in vitro.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агаджанян Н.А., Чижов А.Я. Классификация гипоксических состояний. – М.: 1998. – 24 с.

2. Антонов В.Д., Смирнова В.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. — М.: Наука., 1992. — 136 с.

3. Барбашова З. И. Современные представления о перестройках клеточного химизма в процессе акклиматизации к гипоксии // Кислородная недостаточность. – Киев, 1963. — С. 380–386.

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина. — 1998.

5. Брагин Е.О., Сороковой В.И., Черников В.П. и др. Изучение катионной проницаемости мембран печени при Са-зависимом аноксическом повреждении in vitro// Вопр. Мед. химии. – 1995. – т. 23. — № 3. – с. 297-302.

6. Владимиров Ю. А., Коган Э. М. Механизмы нарушения биоэнергетических функций мембран митохондрий при тканевой гипоксии // Кардиология. – 1993. – Т.21. — №1. – С. 82-85.

7. Влияние кислородной недостаточности на обмен веществ в тканях// Под ред. Ю.М.Гефтер и М.А.Добринской. — Ленинград, 1962. — вып.2. – 99 с.

8. Вторичная тканевая гипоксия / Под ред. А. З. Колчинской. – Киев, 1983.

9. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции// М.- Мир. – 1997. – 624 с.

10. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. //Под общ. ред. Ю.Л. Шевченко — Спб. – 2000. – 384с.

11. Грибанов Г. А. Методы анализа липидов. Лабораторный практикум. — Калинин: КГУ, 1980.- 51 с.

12. Иванов К.П. Основы энергетики организма: Теоретические и практические аспекты. Том 2. Биологическое окисление и его обеспечение кислородом. — СПб.: Наука, 1993.- 272 с.

13. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов: Пер. с англ. — М.: Мир, 1975.-С. 72-73.

14. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения // СПб: Питер Ком. — 1999. – 512 c.

15. Коэффициент диффузии кислорода в мышечном волокне и факторы, на него влияющие / Баранов В.И., Беличенко В.М., Новосельцев С.В., Шошенко К.А. // Физиология мышечной деятельности: Тез. докл. Междунар. конф. — М.: 2000. — С. 25-26.

16. Левин Г. С., Каменецкая Ц. Л. Метаболизм липидов при кровопотере и шоке. – Ташкент, 1982.

17. Лосев Н.И., Хитров Н.К., Грачев С.В. Патофизиология гипоксических состояний и адаптации организма к гипоксии. — М., 1982.

18. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции //Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1997. – Т. 124. — №9. – С. 244-254.

19. Лукьянова Л.Д., Дудченко А.М., Чернобаева Г.Н. Роль биоэнергетического обмена в формировании долгосрочных механизмов адаптации //В кн.: Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. Материалы II Всерос. конф. — М., 1999. — С. 92.

20. Лушников Е.Ф., Шапиро Н.А. Аутолиз. — М.: 1974. — 200 с.

21. Методы биохимических исследований //Под ред. Прохоровой М.И. — Л.: ЛГУ, 1982. — 215 с.

22. Меерсон Ф. З., Ларионов Н. П., Макарова Е. К. Сократительная функция и эффективность использования сердцем кислорода при адаптации к гипоксии // Кардиология. – 1995. – Т. 15. — №7. – С. 70-78.

23. Постнов Ю. В. Нарушение функций митохондрий и энергетический дефицит // Кардиология. – 2000. – Т. 40. — №10. – С. 4-12.

24. Ребров Л.Б., Козельцев В.А., Шишкин С.С., Дебов С.С. Некоторые энзиматические аспекты посмертного аутолиза //Вестн. АМН СССР. — 1983. — № 10. — С. 82-89.

25. Рябов Г. А. Гипоксия критических состояний. – М.: Медицина, 1991. – С. 107-116.

26. Стикней К., Ван Лир Э. Гипоксия: Пер с англ. – М.: Медицина,1967.

27. Терентьев П.В., Растова Н.С. Практикум по биометрии. — Л.: ЛГУ. — 1977.

28. Физиология человека / Бабский Е. Б., Зубков А. А., Косицкий Г. И., Ходоров Б. И. – М.: Медицина, 1966.

29. Хазер И. М. О потенциальных приспособительно-компенсаторных функциях организма при гипоксии // Кислородная недостаточность. – Киев, 1963. – 142 с.

30. Чарный А. М. Патофизиология гипоксических состояний. — М.:
Медгиз, 1961 г.

31. Шабанова И. А. Обмен жирных кислот в сердечной мышце // Вопр. мед. химии. – 1995. – Т. 7. – вып. 5. – С. 451-459.

32. Bligh E., Dyer W.A. A rapid method of total lipid extraction and purification// Can. J. Biochem. — 1959. — 37. — № 8. — Р. 911-917.